Enviro-Biotics® מעכב את זיהום הנגיף SARS-CoV2 pseudovirus.

  Francesco Piacente1, Laura Sturla1, Mirko Magnone1, Katia Cortese2, Cristina Gagliani2, Moti Rebhun3, Hila Weissman3, Rotem Link3, Martin H. Bluth3,4,5

1. ME.S.section of Biochemistry, University of Genova, 16132 Genova; Italy
2. ME.S. section of Human Anatomy, University of Genova, 16132 Genova, Italy
3. Department of Pathology, Maimonides Medical Center, Brooklyn, NY, USA
4. Wayne State University School of Medicine, Detroit, MI, USA

*Correspondence to: Martin H. Bluth, MD, PhD Professor of Pathology

Wayne State University School of Medicine toxdocs@gmail.com

תקציר
מגיפת קוביד-19 השפיעה על העולם במגוון דרכים שליליות. בעוד שחיסונים, טיפולים וריחוק חברתי הם קריטיים לשליטה בהתפשטות הנגיף, גישות חיטוי אנטי-ויראליות נותרות פחות יעילות עקב תגובות עור קשות של חומרים כימיים מסוימים. דרישות יישום חוזרות ונשנות, בנוסף לכיסוי לא אפקטיבי של משטחים ועלויות מתכלים של אחסון וטיפול. 

היעילות של Enviro-Biotics® מדגימה שינוי פרדיגמה בשליטה על אורגניזמים מדבקים בסביבה. יישום של Enviro-Biotics® לזיהום ב-covid-19 עשוי להווכח כיעיל בהפחתת הדבקות הנגיפית. על מנת לבחון את היעילות האנטי-ויראלית של Enviro-Biotics®, נוצרו שני מבני וירוס PseudoCovid-19, המבטאים את החלבון Spike SARS-CoV2 S ובמקביל חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP) או אנזים לוציפראז (LUC). נוכחות חלבון Spike S על pseudoCovid-19 המיוצר ב-HEK293T אושרה על ידי ניתוח Western blot; יתרה מכך, ניתוח אלקטרונים מיקרוסקופי של העברה על נגיפי הפסאודו שנוצרו אישר כי גודלם של החלקיקים הפסאודו-ויראליים (131 ננומטר) דומה לזה של הנגיף הטבעי SARS-CoV2.

תאי Caco-2 הודבקו בפסאודו-וירוסים והודגרו בנוכחות או בהיעדר Enviro-Biotics® המכיל נבגי Bacillus והוערכו לגבי זיהומים ויראלי בנקודות זמן שונות. דגירה של מיני Bacillus הכלולים ב-Enviro-Biotics® הפחיתה את הזיהום של מבני GFP וגם של LUC pseudoCovid-19 (>99% לאחר שלוש שעות, p<0.001). הפחתות דומות בזיהום הנגיפי נצפו לאחר טיפול ב-Enviro-Biotics® באמצעות (1) ניתוח מיקרוסקופיה קונפוקלית של תאי Caco-2 פלואורסצנטיים שהודגרו עם EGFP-pseudoCovid-19 ו-(2) כמות קריסטל סגולה לאחר היווצרות מושבה המושרה על ידי פורומיצין.

In conclusion,לסיכום, מינים של Bacillus הכלולים ב-Enviro-Biotics® הפחיתו את ההדבקות הנגיפית של וירוס פסאודו-קוביד-19. גישה זו מספקת דרך ייחודית, בעלות נמוכה, יעילה ויציבה להפחתת הדבקות בקוביד-19 והעברת מחלות.

Introduction

מחלת נגיף הקורונה 2019 (COVID-19), הנגרמת על ידי וירוס קורונה חדש, תסמונת נשימה חריפה נגיף קורונה 2 (SARS-CoV-2), היא הגורם למגיפה שהדביקה למעלה מ-180 מיליון אנשים ברחבי העולם עם תמותה של למעלה מ-4 מיליון אנשים [https://www.worldometers.info/coronavirus/]. למרות שיפורים בהתנהלות, האבחון והטיפול בבריאות הציבור, קיים צורך עז לייעל את כל המשאבים כדי למזער את התפשטות הנגיף. בעוד שריחוק חברתי, חבישת מסכות ושטיפת ידיים נותרו מרכיב עיקרי בהתנהלות אנטי-ויראלית, ההתפשטות הוויראלית נמשכת ברחבי העולם. למרות היעילות, לשימוש במסכות פנים יש מגבלות כולל, סוג המסכות (1), שמירה על איטום אורופרינגלי תקין (2), החמרת קשיי נשימה כרוניים (3,4), ויעילות שימוש מוטלת בספק באוכלוסיות נבחרות כגון ילדים ( 5,6).

מלבד אסטרטגיות חיסון, גישות נוספות להעברה נגיפית כוללות יישומי חיטוי כולל אלכוהול, חומרי ניקוי, יוד, נתרן היפוכלוריט (אקונומיקה), מי חמצן, כלור דו חמצני, גלוטאראלדהיד, קרינה אולטרה סגולה וטיהור אוויר (7,8). עם זאת, גישות טיהור באמצעות חומרי ניקוי דורשות מחזורים רציפים של יישומים המטפחים גירוי או ביטוי של מחלה של חומרים נבחרים לאנשים רגישים (9,10) וכתוצאה מכך עלויות מוגברות הקשורות לחומרים מסוכנים, משלוח, אחסון ודרישות יישום חוזר תכופות. יתר על כן, שטיפת ידיים מתמדת, כמרכיב עיקרי בתרגול הפחתת העברה אנטי-ויראלית, נקשרה לשכיחות מוגברת של דרמטיטיס מגע ומצבים דרמטולוגיים אחרים (11,12). קיים צורך בהתערבויות חלופיות באופן ברור.Enviro-Biotics® מייצגת תחום חדש של פרוביוטיקה סביבתית, שבו מיקרואורגניזמים תמימים המופיעים באופן טבעי, כגון מיני Bacillus (כלומר B. subtilis, B. pumilus ו-B. megaterium) מספקים מיקרוביום לסביבה (13).Enviro-Biotics® מסוגלים ליצור מושבות על משטחים עליהם הם מיושמים, ולהוציא באופן תחרותי אורגניזמים מזיקים אחרים על ידי מניעת התפשטות והישרדות של גורמים זיהומיים כאלה, ובכך לספק סביבה יציבה ומאוזנת מבחינה היגיינית (14). יתר על כן, ®Enviro-Biotics ניתנת להפצה באמצעות אירוסוליזציה ומסוגלות לשרוד ולהתיישב על משטחים לא ביולוגיים. זה מספק "כיסוי" טוב יותר מפני גורמים זיהומיים בהשוואה להפצה קונבנציונלית מבוססת מגבת או רפידות של חומרי ניקוי, שניתן לשלול בסדקים ובמשטחים לא אחידים. התנהלות כזו יכולה להציע אפקט ארוך טווח עם צריכת מוצר מינימלית ועלות מופחתת..Enviro-Biotics® הוכחה כיעילה בחיטוי סביבות בתי חולים ומתן חלופה "ירוקה" לחומרי חיטוי כימיים נפוצים. מחקרים קודמים הראו את ההשפעות המיטיבות של Enviro-Biotics® נגד S. aureus, P. aeruginosa, K. pneumoniae, E. faecalis, C. Difficile, A. baumannii ו-Albicans, כאורגניזמים מייצגים האחראים לזיהומים נרכשים בבתי חולים (HAI) (14,15).מחקרים אלה הראו גם שהתערבויות מסוג Enviro-Biotics® היו יעילות עד 80% יותר מאשר חומרי חיטוי כימיים קונבנציונליים, בהפחתת עומסי חיידקים שעלולים להיות פתוגניים. יתר על כן, למרות פוטנציאל מתמשך לזיהומים הקשורים לטיפול רפואי (HAI) (ממבקרים, חולים, צוות), ההפחתה הנצפית בעומס המיקרוביאלי נשמרה ביציבות ברמות נמוכות לאחר היישום (14).תפקידה של Enviro-Biotics® במחלות ויראליות הוכיח גם השפעות מועילות במודל עכברי של וירוס סינציטיאלי נשימתי (16) על ידי הגדלת מולקולות אפקטורים אנטי-ויראליים וכי פפטידוגליקנים ספציפיים (PG) מ-Bacillus subtilis הפחיתו זיהום ויראלי ביותר מפי -10,000 בהשוואה ל-PG ממינים אחרים של חיידקים

כאן, הערכנו את היכולת של Enviro-Biotics® על-Covid-19 להפחית את הזיהום הנגיפי כהתערבות חדשנית פוטנציאלית נגד Covid-19.

שיטות

תרבית תאים

תאי HEK293T (American Type Culture Collection, Rockville, MD, ארה"ב) טופחו במדיום Eagle's שונה של Dulbecco (DMEM, Merck, מילאנו, איטליה) בתוספת של 10% סרום בקר עוברי (Merck), 2mM L-גלוטמין ו-1% פניצילין/ תמיסת סטרפטומיצין (Merck) ב-5% CO2 ו-37 מעלות צלזיוס.

תאי Caco-2 (מפעל תאים, בית החולים סן מרטינו, ג'נובה, איטליה) תורבו במדיום Minimum Essential של Eagle (Merck) בתוספת 20% סרום בקר עוברי (Merck), 2mM L-גלוטמין ו-1% תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין (Merck) ) ב-5% CO2 ו-37 מעלות צלזיוס.

Lentiviral Covid-19 production

שני מבני לנטי-וירוס פסאודוטיפוסים שונים האורזים את החלבון Spike SARS-CoV2 נוצרו באמצעות העברה משותפת של HEK293T עם הוקטורים הבאים: לייצור lentivirus פסאודוטייפ המבטא חלבון Spike S וחלבון EGFP (EGFP-pseudoCovid-19) נעשה שימוש בשילוב הווקטורים pRP חלבון -CMV-SARS-CoV2 S, pLV-Puro-CMV-EGFP (Vector Builder, שיקגו, IL, ארה"ב) ופלסמיד האריזה pCMV Delta R8.2 המקודד Gag-Pol, Tat ו-Rev (Addgene, MA,. ארה"ב). לייצור lentivirus פסאודוטייפ המבטא חלבון Spike S ואנזים לוציפראז (LUC-pseudoCovid-19) כל הוקטורים היו זהים ל-EGFP-pseudoCovid מלבד הווקטור pLV-Puro-CMV-EGFP שהוחלף ב-pLV-Puro – וקטור EF1A-Luciferase (Vector Builder). בקצרה, זרעו תאי HEK293T (300,000 תאים על פטרי 6 ס"מ). לאחר 24 שעות תערובת של וקטורים לנטי-ויראליים (1 מיקרוגרם של pRP-CMV-SARS-CoV2 S, 0.5 מיקרוגרם של pLV-Puro-CMV-EGFP או pLV-Puro-EF1A-Luciferase, 0,9 מיקרוגרם של pCMV Delta R8.2) הודגר במשך 20 דקות ב-400 μl של DMEM המכיל 8 μl של Transit-293 Transfection Reagent (Mirus, Tema Ricerca, מילאנו, איטליה) והוסף לתאי HEK293T בנוכחות DMEM ללא פניצילין-סטרפטומיצין כדי לקדם טרנספקציה של תאים. 24 שעות לאחר ההעברה, המדיום HEK293T הוחלף ב-DMEM מלא כדי להגביר את הייצור הפסאודו-ויראלי. הסופרנטנט המכיל חלקיקי lentiviral נקצר ב-48 שעות (מחזור ראשון) ו-72 שעות (מחזור שני) לאחר ההעברה, סונן עם מסנן בקוטר 0.45 מיקרומטר, וטיהור לפי הפרוטוקול המתואר ב- Kutner, R.H. et al. (18). בקצרה 12 מ"ל של סופרנטנט הופקד על כרית המכילה 10% סוכרוז ב-50 מ"מ Tris-HCl pH 7.4, 100 מ"מ NaCl ו-0.5 מ"מ EDTA ובוצע בצנטריפוגה למשך 2 שעות ב-100,000xg ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה שוחרר הסופרנטנט והגלולה המכילה את הפסאודו-וירוס נשטפה פעם אחת עם סלין פוספט (PBS) והושעה מחדש ב-100 μl של PBS.

Covid-19 titration

טיטרציה של ה-pseudoCovid-19 בוצעה על מנת לברר את מספר החלקיקים הנגיפים לנפח המופעלים בכל דגימה של אלה המשמשים במבחנים. בקצרה, כמות יחידות ההמרה למיליליטר (TU/ml) הקיימות בהכנת pseudoCovid-19 חושבה כמספר תאי Caco-2 פלואורסצנטיים בבארות של כל דילול שנעשה וזוהה בניתוח FACS (Calibur, Beckman Coulter, U.S.A. ). ה-TU/ml חושב בבארות שבהן מספר התאים הפלורסנטים היה נמוך מ-30% ממספר התאים הכולל. ערכי ה- TU/ml של כל דילול הובאו לממוצע כדי להגיע לריכוז הסופי של pseudoCovid19 שהיה 6.9 x 105 TU/ml בכל אצווה שהופקה.

Western blot analysis.

ביטוי של חלבון ספייק Sars-CoV2 על מבנה ה-pseudoCovid-19 שנוצר, לאחר ייצורו בתאי HEK293T שעברו בדיקה, הוערך על ידי אנליזה של Western blot בקצרה, 30 מ"ל מהנגיף המיוצר והמטוהר (עם או בלי ביטוי חלבון Spike S) הוסיפו עם 10 ul של תמיסת חיץ כפי שתואר קודם לכן (19) והורתח 10 דקות. לאחר מכן הדגימות הועברו ל-8% SDS-PAGE ואחריו Western blot על ממברנת ניטרוצלולוזה (Bio-Rad, מילאנו, איטליה). החלבון Spike S הועבר לממברנה לאחר זיהוי Western blot על ידי נוגדן ראשוני ספציפי מדולל 1:1000 (קוד #PA5112048, Thermo Scientific, U.S.A). Goat anti- Rabbit IgG HRP מצומד מדולל 1:5000 שימש לזיהוי הנוגדן העיקרי. אות הכימילומינסנציה של הנוגדן המשני נרכש על ידי Chemi-Doc System (Bio-Rad) לאחר דגירת ממברנה עם ECL™ Western blotting detection reagent (GE-Healthcare Life Sciences, Milan, Italy).
ניתוח מיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM) על PseudoCovid-19ניתוח TEM על תכשירים מבודדים מסוג lentiviral pseudoCovid-19 בוצע כדלקמן. ההכנות הפסאודו-ויראליות הושעו מחדש ב-20 μL PBS (pH 7.4) ותוקנו על ידי הוספת נפח שווה של 2% פרפורמלדהיד בבופר פוספט של 0.1 מול/ליטר (pH 7.4). לאחר מכן נספגו פסאודו נגיפים במשך 10 דקות לרשתות נחושת מצופות פחמן על ידי ריחוף הרשתות על טיפות של 5 μl על פרפילם. לאחר מכן, רשתות עם וירוסים מודבקים נשטפו ב-PBS והוצבעו באופן שלילי ב-2% אורניל אצטט למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. רשתות מוכתמות הוטבעו במתילצלולוזה 2.5% לשימור משופר ויובשו באוויר לפני הבדיקה. מיקרוגרפים אלקטרונים צולמו במיקרוסקופ Hitachi TEM (סדרת HT7800, טוקיו, יפן) מצויד במצלמה דיגיטלית Megaview 3 ותוכנת Radius (EMSIS, גרמניה).

PseudoCovid-19 בדיקת הידבקות שיורית בנוכחות Enviro-Biotics®

האינטראקציה בין ה-Enviro-Biotics® (BetterAir, ישראל), המכילה נבגי Bacillus, לבין PseudoCovid-19 נבדקה באמצעות כיסוי צלחת פלסטיק סטרילי המכיל 96 בארות. הניסויים בוצעו במנדף ביולוגי כבוי סגור הרמטית בנפח פנימי של 0.42 מ"ק בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס וב-80% RH.

בקצרה, נבגי ה-Enviro-Biotics® Bacillus, הכלולים במיכל התרסיס המסחרי של Betterair, רוססו על מכסי הבארות, עד שהגיעו לנפח של 30 µl/באר ולאחר מכן הוספת 10 µl של בופר סלין לכל באר. כביקורת שלילית נוספו 40 μl של בופר סלין בבארות ייעודיות בהעדר נבגים. הצלחות הודגרו מראש במנדף זרימה שלילית למשך 4 שעות.

בניסוי הראשון, נוספו לכל באר 30 µl של EGFP-pseudoCovid-19 (המכיל כ-20.7 x 103 חלקיקי pseudoCovid-19 לפי הטיטרציה שבוצעה) והניב נפח סופי של 70 µl/באר. נבדקו חמישה זמני דגירה שונים של חיידקים-וירוסים: 0 דקות, 15 דקות, 30 דקות, שעה אחת ו-3 שעות בשלושה עותקים.

בסוף כל דגירה של נקודת זמן, דגימות נאספו ממשטח באר הפלסטיק, הועברו לצינור של 0.2 מ"ל, עברו צנטריפוגה של 3,500xɡ למשך 8 דקות והסופרנטנט שהוחזר סונן (מסנן מוחלט של 0.2 מיקרון) לסילוק כל פסולת חיידקים.

מיד לאחר הסינון, הסופרנטנט המשוחזר של כל דגימה הועבר לצלחות 96-בארות בהן נזרעו תאי Caco-2 (15,000 תאים/באר, זרעו 24 שעות לפני הגירוי). תאי Caco-2 הודגרו עם הסופרנטנט המשוחזר למשך 72 שעות; בסיום דגירה כזו, תאי Caco-2 (הנובעים מכל נקודת זמן ניסויית שונה) נמדדו עבור הקרינה שלהם על ידי ספקטרופלואורמטר (BMG Labtech, Clario starplus) כדי לכמת את שאר הזיהומים של EGFP-pseudoCovid-19 לאחר הדגירה שלו או לא עם Enviro-Biotics®. לאחר זיהוי פלואורמטרי זה, על אותם תאים בוצעה רכישת ניתוח איכותי על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקאלי.

בדיקת אי-אקטיבציה שנייה לזיהומיות של pseudoCovid-19 בנוכחות ה-Enviro-Biotics® בוצעה על ידי שימוש ב-LUC-pseudoCovid-19 (במקום EGFP-pseudoCovid-19) על מנת לאמת את היעילות הנגיפים של Bacillus עם מערכת זיהוי אחרת . כל תנאי הניסוי היו זהים לניסוי EGFP-pseudoCovid-19 למעט (1) זמן הדגירה על תאי Caco-2 עם הסופרנטנטים שהתאוששו נמשך 120 שעות ו- (2) הערכת שאר הזיהומים על התאים שהיה מכומת על ידי רכישת כימילומינסנציה כפעילות luciferase (BMG Labtech, Clario starplus).

מיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית איכותית של תאי Caco-2 נגועים

לאחר 72 שעות של דגירה של תאי Caco-2 (15,000 תאים/באר זרעו בצלחת 96-בארות) עם הסופרנטנטים הנובעים מזמן 0 וזמן 3 שעות של בדיקת הדבקות השארית עם EGFP-pseudoCovid-19 בנוכחות או לא. של Enviro-Biotics®, תמונות איכותיות התקבלו עם מיקרוסקופ קונפוקאלי פלואורסצנטי.

בדיקת יצירת מושבות

בדיקת יצירת מושבות בוצעה על אותם תאי Caco-2 שהודגרו במשך 72 שעות עם הסופרנטנטים ששוחזרו על ידי ניסוי אי ההפעלה של EGFP-pseudoCovid-19 לאחר רכישה פלואורימטרית של הידבקות הנגיפית הנותרת. בקצרה, 2 מ"ג/מ"ל פורומיצין (Merck, ארה"ב) נוספו כל 48 שעות במשך 12 ימים לתאי Caco-2. לאחר 12 ימים, המושבות נצבעו בסגול קריסטל של 0.5%.

פיתרון. ההבדל בכמות המושבות בין הדגימות זוהה על ידי המסת הצבע עם תמיסת SDS 2% וכומת על ידי ספיגה ספקטרופוטומטרית ב-570 ננומטר.

נטרול פעילות PseudoCovid-19.

מספר החיידקים הפעילים שמקורם בנבגי Enviro-Biotics המשמשים בניסויים של השבתת pseudoCovid-19, חושב על ידי ביצוע גידול חיידקי מושבה על מדיום אגר מוצק (אגר 15 גרם/ליטר, תמצית שמרים 2 גרם/ליטר, 2 גרם /L אבקת חלב רזה, 16 גרם/ליטר גלוקוז, 5 גרם/ליטר נתרן כלורי). בקצרה, נקודת הדגירה בזמן אפס של הניסוי להערכת השבתת pseudoCovid-19 בוצעה בצנטריפוגה ב-3,500xg למשך 8 דקות. הכדורית המכילה את החיידקים, הושעתה מחדש ב-200 ul של PBS (השעיית חיידקים). בוצעו דילולים סדרתיים מתרחיף מלאי החיידקים (1:100, 1:10,000 ו-1:1,000,000) ו-250 מ"ל מכל דילול נפרסו בשני עותקים על צלחת פטרי המכילה מדיום אגר מוצק (הרכב: אגר 15 גרם/ליטר + 2 גרם /L תמצית שמרים, 2 גרם/ליטר אבקת חלב רזה, 16 גרם/ליטר גלוקוז, 5 גרם/ליטר נתרן כלורי). צלחת פטרי עם מדיום אגר בלבד שימשה כהשוואה. לאחר דגירה של לילה ב-37 מעלות צלזיוס המושבות נספרו. ספירת המושבות הייתה אפשרית רק בדילול 1:1,000,000 כאשר כל מושבה הייתה מופרדת היטב משנייה בכל פני השטח הפטרי. הכמות הממוצעת הסופית של חיידקים חושבה כ-CFU/mL.

תוצאות

אישור ביטוי חלבון S ואפיון ויראלי של pseudoCovid-19.

הביטוי של חלבון SARS-CoV2 S בנגיפים שנוצרו לאחר טרנספקציה של תאי HEK293T אושר על ידי ניתוח Western blot על lysates של וירוסים מיוצרים ומטוהרים. כפי שמוצג באיור 1, ה-pseudoCovid-19 המיוצר ביטא את חלבון S האופייני ל-SARS הטבעי

CoV2 שהוכר במלואו עם נוגדן החלבון האנטי-ספייק הספציפי. ניתוח מיקרוסקופיה של העברת אלקטרונים (TEM) על הפסאודו-וירוסים שנוצרו, שניהם מבטאים EGFP ו-LUC, אישרה שגודל החלקיקים הפסאודו-ויראליים דומה לזה של הנגיף הטבעי SARS-CoV2 (20) וכי הפסאודו-קוביד-19 שהושג מתא HEK293T ההעברה הייתה שלמה (איור 2).

תוצאות טיטרציה

כדי לכמת את ריכוז החלקיקים הנגיפים בתכשירים ששימשו בכל הניסויים, בוצע טיטרציה של וירוס. ריכוז החלקיקים הנגיפים בוטא כיחידות התמרה למיליליטר (TU/ml). תאי CaCo-2 שהועברו בדילול פי שניים של EGFP-pseudoCovid-19 נותחו על ידי FACS כדי לזהות את מספר התאים הפלורסנטים בבארות של כל דילול. ה-TU/ml חושב בבארות שבהן מספר התאים הפלורסנטים היה נמוך מ-30% מהכלל (איור 3). ה-TU/ml הביא ל-6.9 x 105, ולכן בכל נקודת ניסוי מספר חלקיקי הפסאודו-וירוס היה 20.7X103.

ניטרול PseudoCovid-19 על ידי תאי Enviro-Biotics® Bacillusתרחיף נבגי Enviro-Biotics® Bacillus הונח על המשטח שנבדק 4 שעות לפני הרכבה ויראלית. מרכז תאי ה-Bacillus שרוססו על פני השטח שנבדקו, לאחר 4 שעות של דגירה מוקדמת ולפני תוספת הפסאודו-קוביד-19, נספרו עם ערך ממוצע של
108*1.42 CFU/ml עבור כל נקודת זמן דגירה (נתונים לא מוצגים).
בבדיקה הראשונית נעשה שימוש במבנה EGFP-pseudoCovid-19. נבגי Enviro-Biotics® Bacillus הצליחו לגרום להשבתה מהירה של חלקיקים הנגיפיים: 67% מהחלקים הנגיפיים של EGFP כבר נוטרלו לאחר 15 דקות דגירה עם Enviro-Biotics® בהשוואה לבקרה (פסאודו-וירוס מודגרת עם בופר סלין בלבד) ואחוז זה לא הגיע. 97.7% לאחר דגירה של 3 שעות (איור 4; טבלה 1A). ערך הפחתת Log, מחושב עבור כל נקודת דגירה כהפרש בין Log10 של הקרינה של הבקרה (פסאודו-וירוס בלבד)
Log10 של הקרינה שנמדדה בדגימה שבה הפסאודו-וירוס היה בנוכחות הנבגים, היה 0.5 ו-1.6 בנוכחות EGFP-pseudoCovid-19 לאחר 15 דקות ו-3 שעות, בהתאמה (טבלה 1A). הקניית מיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית איכותית אישרה את השבתת הפסאודו-וירוס כמעט מלאה תוך 3 שעות (איור 5). יתרה כתוצאה, לאחר זיהוי ספק טרופלומטרי, הוערכהאור הנגיפים בתיווך תאי Bacillus על ידי הוספת פורומיצין לכל באר מתאי המארח Caco-2 בהתייחס להיווצרות המושבה. כפי שמוצג באיור 6, המתאימים שטופלו בסופרנטנטים שמקורם בדגירות שבהן הודגר pseudoCovid-19 בנוכחות תאי Bacillus הפחיתו מאוד את היווצרות המושבות וההישרדות הנגועים ב-pseudoCovid-19. ואכן, כמות הקריסטל סגול על ידי ספיגה ספקטרופוטומטרית ב-570 ננומטר של הגברת המומסים, התואמים למושבות במבחן יצירת המושבות (איור 7), היו בקנה אחד עם ערכי הקרינה, המציגים אי הפעלה של הנגיף, שדווחו באיור 4.
אישור נוסף של Bacillus המכיל Enviro-Biotics® בעל האנטי-ויראלית התקבל על ידי אתגר של תאי Caco-2 מבנה pseudoCovid-19 שונה שבוEGFP הוחלף ב-LUC. בדומה לניסוי שהדגים את ביטול ההפעלה של EGFP-pseudoCovid-19, הנגועים מתאימים ב-LUC-pseudoCovid-19 נמצאו גם רגישים למתאימים המכילים Enviro-Biotics® Bacillus. אחוז האינאקטיבציה המתווכת על ידי נבגי Enviro-Biotics® Bacillus, כאשר זוהה כהקניית כימילומינסנציה, היה 70% לאחר 15 דקות דגירה וכ-99% לאחר 3 שעות (איור 8; טבלה 1B רוס), כמעט תוצאות שהושגו עם EGFP מחקרי בניית פסאודו-וי . יתר על כן, ההפחתה המחושבת לאחר 15 דקות ו-3 שעות הייתה 0.8 ו-1.85, בהתאמה (טבלה 1B). התוצאות שהתקבלו במחקרי בניית פסאודו-וירוס LUC החלופיים אישרו את השפעות האינאקטיבציה של Enviro-Biotics® שנצפו במחקרי בניית הפסאודו-וירוס EGFP, מה שמספק תמיכה נוספת לשימוש ב-Enviro-Biotics כאופן אנטי-ויראלי בשתי גישות שונות באופן ייחודי.

Discussion

המחקרים הנוכחיים מראים ש – ®Enviro-Biotics עשויה לספק הגנה מפני קוביד-19.

זה חשוב מכיוון שהדרכים הנוכחיות להפחתת ההעברה וההדבקות הנגיפית של קוביד-19
כולל ריחוק חברתי, מיסוך ושטיפת ידיים אינן יעילות לחלוטין או נמצאות בשימוש אוניברסלי.
לשם כך, שילוב של Enviro-Biotics® עשוי לספק דרך הגנה נוספת והכרחית להפחתת העברה נגיפית.

המאפיינים החשובים הבאים של Enviro-Biotics® בולטים בכך שהם (1) יציבות ויוצרות נבגים שניתן לשמור במגוון מכלים ללא תשומת לב מיוחדת לטמפרטורה ו/או לתנאי שילוח וטיפול בחומרים מסוכנים, מה שהופך אותם לזמינים אוניברסלית בהשוואה לתכשירי ניקוי כימיים רבים הדורשים אישורים, ציוד מגן אישי או מתקנים מיוחדים, (2) ניתנים ליישום באמצעות אירוסוליזציה על רוב המשטחים. ניתן להרחיב את היישום על ידי ריסוס באיזורים שמועדים להתפשטות זיהומים דרך חללים סגורים (רכבים, חדרי מלון), או ע"י התזה מדודה ומתוכנתת מראש (אולמות קונצרטים, פתחי חימום/קירור ביתיים), (3) ניתן להרחיב את היישום באמצעות אירוסוליזציה לכיסוי משטחים יעיל יותר מקצף ונוזלים קונבנציונליים כאשר מדובר במשטחים לא אחידים כגון אלה המכילים נקבוביות, סדקים או חללים, (4) יכולה להתחרות באופן פעיל עם אורגניזמים מדבקים הנשארים רדומים ומועדים להתפרץ מחדש כאשר יופיע איום מדבק חדש.

דרך כזו תהיה חסכונית, יציבה, ניתנת לאכלוס מחדש, ידידותית לסביבה ותטפח הגנה לאורך זמן. כל אלו מהווים יתרון ייחודי לשוק שירותי הבריאות בהשוואה להתערבויות קונבנציונליות.

מחקרים שונים הוכיחו את ההשפעות המועילות של Enviro-Biotics®.
LaFauci ועמיתיו (14) השתמשו ב-Enviro-Biotics® המכילה מינים שונים של Bacillus (B. subtilis, B. pumilus, B. megaterium) במערכת הניקוי הפרוביוטית שלהם (PCHS). במחקרים אלה, זרעו אורגניזמים מדבקים על משטחים (כיור, רצפה ושולחן עבודה), לאחר מכן משטחים אלו חוטאו עם Enviro-Biotics® והוערכו עבור זיהום מחדש. תוספת של Enviro-Biotics® הפחיתה אורגניזמים הקשורים ל-HIA (S. aureus, P. aeruginosa, K. pneumoniae, A. baumannii, E. faecalis ו-C. albicans) יותר מ-92% לאחר 24 שעות. בנוסף, ניסויי שדה, כדי להעריך את היעילות של פרוביוטיקה.

להכיל פתוגנים בסביבת בית חולים סטנדרטית (צוות, חולים, משפחה), הדגימה חיסול של חיידקים פתוגניים לאחר שש שעות בלבד, גם לאחר זיהום מחדש. דבר זה מדגים עוד יותר את העמידות של Enviro-Biotics® לאורך זמן, אשר נחשבת כנובעת מהתייצבות של biofilms שממשיך להפחית שגשוג של מיקרואורגניזמים פתוגניים (21). מחקרים של Vandini ועמיתיו (22) הראו שיישום של תמיסת Enviro-Biotics® המכיל Bacillus בבית חולים הפחית את העומס המיקרוביאלי של S. aureus, Coliforms, Pseudomonas spp. ו-Candida spp., מעל 80% ושמרו על ההשפעה האנטי-מיקרוביאלית במשך חמישה ימים.

למרות ההשפעות המועילות המדווחות של Enviro-Biotics®, והעובדה שמינים של Bacillus מוכרים בדרך כלל כבטוחים (GRAS) על ידי ה-FDA (23), לא ניתן להתעלם מהשאלה אם יישומים אלה בטוחים לבני אדם בסביבה הקלינית . לשם כך, קאסלי ועמיתיו

(15) חקרו את השפעה של חומר ניקוי המבוסס על Enviro-Biotics® Bacillus על פתוגנים בסביבה רפואית. בנוסף, הם העריכו את החומר של Bacilli שמקורו ב-Enviro-Biotics® להדביק חולים מאושפזים. לא רק שהם מדווחים על ירידה במידות לאנטיוטיקה בקרב אוכלוסיית החיידקים המזהמים, אלאכותבים מצאו עוד שחולים חיוביים ל-HAI במחקרים אלה היו שליליים עבור Bacilli. יתר על כן, התערבותם של PCHS Enviro-Biotics® הראתה ירידה של 33%-100% בזנים עמידים לאנטיביוטיקה, ירידה של 60% בצריכת תרופות אנטי-מיקרוביאליות מסוג HAI והפחתה של 75% בעליויות הקשורות למחלה (15). Tarricone ועמיתיו (13) דיווחים באופן דומה ששימוש מבוסס Enviro-Biotics® במקום תכשירי ניקוי קונבנציונליים ימנע 31,000 HAI ו-8,500 מקרי מידות לאנטיוטיקה לאחר חמש שנים ומינימום עלויות ב-14 מיליון יורו (16.8 מיליון דולר), עם למעלה מ-80% אלה הן עבור טיפול ב-HAI עמידים. באופן דומה, דיווחים אחר של Kim et al (24) הראו את ההשפעות המועילות של Enviro-Biotics® במודלים של אסתמה של בעלי חיים על ידיכת בטיחות, הערנות אנטי-מיקרוביאלית ופעילות נגד פתוגנים באוויר.
במחקרים אלו, הזלפה תוך אפית ושאיפת ®Enviro-Biotics (B. subtilis ו-amyloliquefaciens) במודל של דלקת ריאות המושרה על ידי אולבומין (OVA) הפחיתו ציטוקנים מסוג Hepler Type 2 (Th2) ברמות שעתוק וחלבונים.

1. במחקרים אלו, הזלפה תוך-אפית ושאיפת ®Enviro-Biotics (B. subtilis ו-amyloliquefaciens) במודל של דלקת ריאות המושרה על ידי אולבומין (OVA) הפחיתו ציטוקינים מסוג Hepler Type 2 (Th2) ברמות שעתוק וחלבונים.

2. Enviro-Biotics® הורידה את ביטויי ה-mRNA של IL-4 ו-IL-5 ו/או את רמות החלבון מבלי לשנות את IL-10 בדלקת ריאות הנגרמת על ידי OVA in vivo תוך שימת דגש על ההשפעות האימונומודולטוריות שלהם. מטבוליטים מסוג Bacillus הכוללים 2,3-בוטנדיול, פרופילן גליקול, חומצה מאלונית, חומצה 2-methylbutyric, חומצה לקטית, סובטיליזין וחומצה אקונית זוהו כגורמים אנטי-מיקרוביאליים אנטי-פטרייתיים אפשריים, הפועלים בנפרד ו/או באמצעות השפעות נוספות וסינרגיות. היישום של Enviro-Biotics® אינו מוגבל למוסדות מעבדה ושירותי בריאות. מבנים הנתונים לצמיחת חיידקים או עובש וסובלים מתסמונת הבניין החולה (25) עלולים לעלות מאות אלפי דולרים לתיקון על ידי קבלנים קונבנציונליים או להיות נתונים להריסה. בנוסף, בנייני משרדים ומערכות בתי ספר יכולים להפיק תועלת מ-Enviro-Biotics® כדי לשמור על סביבת עבודה יציבה מבחינה היגיינית, להפחית את העברת מחלות זיהומיות ולהפחית ימי עבודה או ימי לימודים שאבדו, כמו גם חוויות משפטיות כתוצאה מנזקים במקום העבודה (26-28) .

The application of Enviro-Biotics® in viral infection has also been reported. Hong and colleagues

• studied the effects of intranasal administration of Bacillus subtilis containing Enviro-Biotics® in a murine model of RSV. They found that Enviro-Biotics® administration induced expansion of alveolar macrophages in addition to activation and enhanced production of inflammatory cytokines, macrophage differentiation and a profound reduction of viral titers and RSV related lung injury, suggesting its use as a potential therapeutic approach against RSV.

Our studies investigated the effect of Bacillus species containing Enviro-Biotics® on coronavirus infectivity. We utilized a  coronavirus that expressed the wild-type coronavirus spike protein unique to CoV2. This virus was used to infect Caco-2 cells that contain the ACE2 receptor

• in the presence and absence of Enviro-Biotics®. We found that Enviro-Biotics® reduced covid infectivity >97% after three hours using both GFP and LUC reporter constructs and that puromycin induced colony formation was also reduced in the treatment group. These findings are in concert with other studies that assessed the effect of Enviro-Biotics® in other viral infections

including severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) or Middle East respiratory syndrome CoV (MERS-CoV) systems (17). In those studies, peptidoglycan (PG) components from

1. subtilis reduced infection >10,000-fold, while PG from other bacterial species did not. The authors identified a cyclic lipopeptide – surfactin – that was responsible for the observed anti-viral effects and that surfactin treatment was efficacious against many enveloped viruses in vitro, including influenza A virus (strains H1N1 and H3N2), Zika, Dugbe, Nipah, Crimean-Congo hemorrhagic fever, Chikungunya, Una, Mayaro, and Ebola. Collectively, these results highlight remarkable anti-viral effects of Enviro-Biotics® and their potential to impact viral pathogenesis.

CONCLUSION

Enviro-Biotics® represent an emerging environmental probiotic application to the curtailment of infectious organisms. The results herein reported indicate the significant anti-viral activity of Bacillus species containing Enviro-Biotics® on a Covid-19 viral infection construct, having full homology with the natural SARS-CoV-2 virus, and the near eradication of infectivity in short time. These results, in conjunction with previously reported beneficial effects in various disease transmission systems, further edify the potential use of Enviro-Biotics® as a novel intervention to reduce SARS-CoV2 infection.

References

 Tirupathi R, Bharathidasan K, Palabindala V, Salim SA, Al-Tawfiq JA. Comprehensive review of mask utility and challenges during the COVID-19 pandemic. Infez Med. 2020 Jun 1;28(suppl 1):57-63. PMID:

3. Regli A, Sommerfield A, von Ungern-Sternberg BS. The role of fit testing N95/FFP2/FFP3 masks: a narrative review. Anaesthesia. 2021 Jan;76(1):91-100. doi: 10.1111/anae.15261. Epub 2020 Sep 15. PMID:
4. Primov-Fever A, Amir O, Roziner I, Maoz-Segal R, Alon EE, Yakirevitch A. How face masks influence the sinonasal quality of life during the COVID-19 pandemic. Eur Arch

Otorhinolaryngol. 2021 Mar 27:1–7. doi: 10.1007/s00405-021-06752-2. Epub ahead of print. PMID: 33772607; PMCID: PMC7998091.

12. Hopkins SR, Dominelli PB, Davis CK, Guenette JA, Luks AM, Molgat-Seon Y, Sá RC, Sheel AW, Swenson ER, Stickland MK. Face Masks and the Cardiorespiratory Response to Physical Activity in Health and Disease. Ann Am Thorac Soc. 2021 Mar;18(3):399-407. doi: 10.1513/AnnalsATS.202008-990CME. PMID: 33196294; PMCID:
13. Roberge R. Facemask use by children during infectious disease outbreaks. Biosecur Bioterror. 2011 Sep;9(3):225-31. doi: 10.1089/bsp.2011.0009. Epub 2011 Aug 15. PMID:
14. Esposito S, Principi N. To mask or not to mask children to overcome COVID-19. Eur J Pediatr. 2020 Aug;179(8):1267-1270. doi: 10.1007/s00431-020-03674-9. Epub 2020 May PMID: 32388722; PMCID: PMC7210459.
15. Shimabukuro PMS, Duarte ML, Imoto AM, Atallah ÁN, Franco ESB, Peccin MS, Taminato
16. Environmental cleaning to prevent COVID-19 infection. A rapid systematic review. Sao Paulo Med J. 2020 Nov-Dec;138(6):505-514. doi: 10.1590/1516-3180.2020.0417.09092020. PMID: 33206913.
17. Anderson DE, Sivalingam V, Kang AEZ, Ananthanarayanan A, Arumugam H, Jenkins TM, Hadjiat Y, Eggers M. Povidone-Iodine Demonstrates Rapid In Vitro Virucidal Activity Against SARS-CoV-2, The Virus Causing COVID-19 Disease. Infect Dis Ther. 2020 Sep;9(3):669-675. doi: 10.1007/s40121-020-00316-3. Epub 2020 Jul 8. PMID: 32643111; PMCID:
18. Dumas O, Varraso R, Boggs KM, Quinot C, Zock JP, Henneberger PK, Speizer FE, Le Moual N, Camargo CA Jr. Association of Occupational Exposure to Disinfectants With Incidence of Chronic Obstructive Pulmonary Disease Among US Female Nurses. JAMA Netw Open. 2019 Oct 2;2(10):e1913563. doi: 10.1001/jamanetworkopen.2019.13563. PMID: 31626315; PMCID:
19. Ernstgård L, Sjögren B, Johanson G. Acute effects of exposure to vapors of hydrogen peroxide in humans. Toxicol Lett. 2012 Jul 20;212(2):222-7. doi: 10.1016/j.toxlet.2012.05.025. Epub 2012 Jun 5. PMID:
20. Tan SW, Oh CC. Contact Dermatitis from Hand Hygiene Practices in the COVID-19 Pandemic. Ann Acad Med Singap. 2020 Sep;49(9):674-676. PMID:
21. Alluhayyan OB, Alshahri BK, Farhat AM, Alsugair S, Siddiqui JJ, Alghabawy K, AlQefari GB, Alolayan WO, Abu Hashem IA. Occupational-Related Contact Dermatitis: Prevalence and Risk Factors Among Healthcare Workers in the Al'Qassim Region, Saudi Arabia During

the COVID-19 Pandemic. Cureus. 2020 Oct 15;12(10):e10975. doi: 10.7759/cureus.10975. PMID: 33209532; PMCID: PMC7667620.

30. Tarricone R, Rognoni C, Arnoldo L, Mazzacane S, Caselli E. A Probiotic-Based Sanitation System for the Reduction of Healthcare Associated Infections and Antimicrobial Resistances: A Budget Impact Analysis. Pathogens. 2020 Jun 23;9(6):502. doi: 10.3390/pathogens9060502. PMID: 32585922; PMCID:
31. Fauci, Vincenza La (2015). "An Innovative Approach to Hospital Sanitization Using Probiotics: In Vitro and Field Trials". Journal of Microbial & Biochemical Technology (1948-5948), 07 (03).
32. Caselli E, Brusaferro S, Coccagna M, Arnoldo L, Berloco F, Antonioli P, Tarricone R, Pelissero G, Nola S, La Fauci V, Conte A, Tognon L, Villone G, Trua N, Mazzacane S; SAN-ICA Study Group. Reducing healthcare-associated infections incidence by a probiotic- based sanitation system: A multicentre, prospective, intervention study. PLoS One. 2018 Jul 12;13(7):e0199616. doi: 10.1371/journal.pone.0199616. PMID: 30001345; PMCID: PMC6042698.
33. Hong JE, Kye YC, Park SM, Cheon IS, Chu H, Park BC, Park YM, Chang J, Cho JH, Song MK, Han SH, Yun CH. Alveolar Macrophages Treated With Bacillus subtilis Spore Protect Mice Infected With Respiratory Syncytial Virus A2. Front Microbiol. 2019 Mar 12;10:447. doi: 10.3389/fmicb.2019.00447. PMID: 30930867; PMCID:
34. Johnson BA, Hage A, Kalveram B, Mears M, Plante JA, Rodriguez SE, Ding Z, Luo X, Bente D, Bradrick SS, Freiberg AN, Popov V, Rajsbaum R, Rossi S, Russell WK, Menachery VD. Peptidoglycan-Associated Cyclic Lipopeptide Disrupts Viral Infectivity. J Virol. 2019 Oct 29;93(22):e01282-19. doi: 10.1128/JVI.01282-19. PMID: 31462558; PMCID:
35. Kutner RH, Zhang XY, Reiser J. Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nat Protoc. 2009;4(4):495-505. doi: 10.1038/nprot.2009.22. PMID:
36. LAEMMLI, U. K. (08/1970). "Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4". Nature (London) (0028-0836), 227 (5259), p.
37. Brahim Belhaouari, Djamal (08/2020). "The Strengths of Scanning Electron Microscopy in Deciphering SARS-CoV-2 Infectious Cycle". Frontiers in microbiology (1664-302X), 11 .
38. Lakshmanan V, Bais HP. Factors other than root secreted malic acid that contributes toward Bacillus subtilis FB17 colonization on Arabidopsis roots. Plant Signal Behav. 2013 Nov;8(11):e27277. doi: 10.4161/psb.27277. Epub 2013 Dec 5. PMID: 24310121; PMCID: PMC4092310.
39. Mazzacane, Sante (10/2014). "Reduction of the Microbiological Load on Hospital Surfaces Through Probiotic-Based Cleaning Procedures: A New Strategy to Control Nosocomial Infections". Journal of Microbiology & Experimentation (2373-437X), 1 (5).
40. Lee NK, Kim WS, Paik HD. Bacillus strains as human probiotics: characterization, safety, microbiome, and probiotic carrier. Food Sci Biotechnol. 2019 Oct 8;28(5):1297-1305. doi: 10.1007/s10068-019-00691-9. PMID: 31695928; PMCID: PMC6811671.
41. Kim, Hye‐Shin (06/2021). "Assessment of the safety and anti‐inflammatory effects of three Bacillus strains in the respiratory tract". Environmental microbiology (1462-2912), 23 (6), p. 3077.
42. Redlich CA, Sparer J, Cullen MR. Sick-building syndrome. Lancet. 1997 Apr 5;349(9057):1013-6. doi: 10.1016/S0140-6736(96)07220-0. PMID:
43. Ketema RM, Araki A, Ait Bamai Y, Saito T, Kishi R. Lifestyle behaviors and home and school environment in association with sick building syndrome among elementary school children: a cross-sectional study. Environ Health Prev Med. 2020 Jul 11;25(1):28. doi: 10.1186/s12199-020-00869-2. PMID: 32652952; PMCID: PMC7354679.
44. Abbritti G, Muzi G. Indoor air quality and health in offices and other non-industrial working environments. Med Lav. 2006 Mar-Apr;97(2):410-7. PMID: 17017378.
45. Seppänen OA, Fisk WJ. Summary of human responses to ventilation. Indoor Air. 2004;14 Suppl 7:102-18. doi: 10.1111/j.1600-0668.2004.00279.x. PMID:
46. Hong JE, Kye YC, Park SM, Cheon IS, Chu H, Park BC, Park YM, Chang J, Cho JH, Song MK, Han SH, Yun CH. Alveolar Macrophages Treated With Bacillus subtilis Spore Protect Mice Infected With Respiratory Syncytial Virus A2. Front Microbiol. 2019 Mar 12;10:447. doi: 10.3389/fmicb.2019.00447. PMID: 30930867; PMCID:
47. Mossel EC, Huang C, Narayanan K, Makino S, Tesh RB, Peters CJ. Exogenous ACE2 expression allows refractory cell lines to support severe acute respiratory syndrome coronavirus replication. J Virol. 2005 Mar;79(6):3846-50. doi: 10.1128/JVI.79.6.3846- 3850.2005. PMID: 15731278; PMCID:

Fig. 1

Fig. 1 A representative Western blot analysis, performed as described in Methods, on lysates of virus expressing or not the Spike S protein of Covid-19 used for all the tests. The Spike S was identified using a specific mAb (Thermo Scientific, U.S.A) protein on the lysate viruses samples.

Fig. 2

Fig. 2 A representative image of TEM acquisition of the produced Covid-19 (magnification 50000x; 100 Kv). Red arrows indicate the viral particles in the field of acquisition; the yellow box is a zoom image of a single  viral particle. The table summarizes the 2D dimension of Covid-19.

Fig.3

Fig. 3. FACS analysis of EGFP-Covid-19 titration. In panels A-C, a representative sample of non-transduced cells shows the cells totally negative for the presence of green fluorescence. In panels D-E, a representative sample of transduced cells with EGFP-Covid-19 shows a percentage of cells positive for green fluorescence.

Fig. 4

Fig. 4. Fluorimetric quantitation of EGFP-Covid-19 residual infectivity on Caco-2 cells detected as GFP fluorescence presented as Relative Fluorescence Units (RFU), as described in Methods. The background of auto-fluorescence deriving from untreated Caco-2 cells was subtracted for each experimental time point. Each bar is the mean±SD of a triplicate. P value was calculated by unpaired t-Test. ***p< 0.001

Fig. 5

Fig. 5. Fluorescence confocal microscope images (20X magnification) of Caco2 cells incubated for 72 h with the recovered supernatant of EGFP-Covid-19 test at time 0 (T0) and time three h (T3). Panels on the left represent the controls (supernatant of EGFP-Covid-19 alone); panels on the right represent the fluorescence of Caco-2 cells treated with the supernatants of EGFP-Covid-19 incubated with Enviro- Biotic® at T0 (Initiation of Bacillus–virus incubation) and at T3 of the residual infectivity test.

Fig. 6

Fig. 6. Colony forming assay, as described in Methods, of Caco-2 cells incubated for 12 days with the supernatants of the different time point incubations deriving from the EGFP-Covid-19 residual infectivity test. Upper lane: cells incubated with the supernatants of Covid-19 alone; lower lane: cells incubated with the supernatants of Covid-19 treated in the presence of Enviro-Biotics®.

Fig. 7

Fig. 7. Crystal violet quantitation by spectrophotometric absorbance at 570 nm of the dissolved crystals corresponding to the colonies formed in the colony forming assay. Black bars: control (EGFP-Covid- 19 alone); white bars: EGFP-Covid-19 incubated with Enviro-Biotics®

Fig. 8

Fig. 8. Chemiluminescence quantitation of the LUC-Covid-19 residual infectivity detected as luciferase activity, presented as Relative Luciferase Units (RLU). Each bar is the mean±SD of a triplicate. P value was calculated by unpaired t-Test; ***p< 0.001